Polimerazna lančana reakcija
Reakcija lančanog umnožavanja (engl. polymerase chain reaction - PCR) je metoda kojom se umnožava molekul DNK. Metoda omogućava stvaranje velikog broja kopija ciljne DNK sekvence koristeći malu početnu količinu DNK uzorka. Polimerazna lančana reakcija se često koristi u medicinskim i biološkim laboratorijama i ima primenu u detekciji naslednih bolesti, identifikaciji genetskog otiska, dijagnozi infektivnih bolesti, kloniranju gena i testiranju očinstva.
Metodu je stvorio i razradio Keri Malis decembra 1983. Za ovo otkriće je 1993. dobio Nobelovu nagradu za hemiju, sedam godina nakon objavljivanja prvobitnih ideja o metodi. Malisova zamisao je bila da razvije proces pomoću kojeg bi se veštačkim putem uvećavao broj molekula DNK u ciklusima replikacije omogućenim enzimm DNK polimeraze.
DNK polimeraza se prirodno javlja u živim organizmima, u kojim ima funkciju da kopira DNK kada se ćelija deli tokom mitoze i mejoze. Polimeraza kopira tako što se veže na jedan, od dva polinukleotidna lanca koje čine DNK, i stvara lanac komplementaran originalu. U Mulisovoj prvobitnoj metodi enzim je korišćen u kontrolisanom okruženju van organizma. Dva polinukleotidna lanca DNK koji su spiralno uvijeni jedan oko drugog bi se prvo razdvojili grejanjem molekula do 96°S. Međutim pri ovoj temperaturi enzim koji je u ono vreme korišćen bivao je uništen, te je enzim morao biti ponovo dodat nakon svakog ciklusa. Mulisova prvobitna zamisao je bila veoma neefikasna, jer je zahtevala puno vremena, ogromne količine DNK polimeraze i stalnu pažnju tokom celog procesa.
Kasnije, originalna metoda PLR (PCR) je značajno poboljšana upotrebom DNK polimeraze nađene kod termofilnih bakterija koje žive u gejzirima na temperaturama od preko 110°S. DNK polimeraza uzeta od ovakvih organizama je dovoljno stabilna pri visokim temperaturama i ne dolazi do uništenja kada se koristi tokom PLR procesa. Kako nije bilo više potrebe dodavati nove enzime DNK polimeraze nakon svakog ciklusa da zameni enzime uništene temperaturom, ceo proces kopiranja DNK molekula je postao jednostavniji i brži.
PLR ce koristi za kopiranje kratkog unapred određenog dela molekula DNK. Kopirani molekul može u sebi sadržati jedan ili više nezavisnih celina a može predstavljati i samo fragment jedne celine. PCR proces može da kopira samo kratke DNK fragmente, obično do 10 kb (kb= kilo, 1000 parova baza). Različiti molekularni protokoli mogu da kopiraju fragmente i do 40 kb, mada je i ta veličina manja od hromozalnog DNK molekula eukariotske ćelije, na primer, ljudska ćelija sadrži oko tri milijarde nukleotida.
Da bi reakcija bila moguća potrebne su sledeće komponente:
- DNK molekul koji će služiti kao obrazac za kopiranje komplementarnog lanca
- Dva prajmera koji obeležavaju početak i kraj onog dela lanca koji se sintetiše
- Enzim DNK polimeraza, koji vrši samo kopiranje
- Nukleotidi, osnovni elementi od kojih se DNK gradi
- Odgovarajući pufer sa obaveznim sadržajem maghezijum-hlorida
- Ponekad sadrži i interkalacione boje (LCGreen, SYBR green) na osnovu kojih se vrši melting analiza dobijenog uzorka
PCR reakcija je moguća u posebnom uređaju. Uređaj ciklično hladi i greje prethodno opisane reagente po tačno prethodno utvrženom protokolu. Cijene urežaja za Polimeraznu lančanu reakciju zavisno od željenih performansi variraju od 2000$ do 50,000$ za istraživačke svrhe.
PCR reakcija se sastoji od serije ciklusa. Broj ciklusa koji se moraju izvršiti zavisi od količine inicijalne DNK mase od koje počinjemo. Obično se PLR uspešno obavlja bilo gde između 20'45 ciklusa.
Svaki ciklus se sastoji od tri koraka:
1. DNK molekul se prvo zagreje do 94-96°S kako bi se dva lanca koja su prethodno spojena vodoničnim vezama razdvojili. Ovaj korak se naziva denaturizacija, i raskida vodonične veze. Sama denaturizacija je funkcija procenta GC parova u odnosu na ukupan broj parova u sekvenci, kako i njihovog rasporeda unutar same sekvence. Što je veći udeo to je viša temperatura na kojoj dolazi do razdvajanja nizova. Ovo se objašnjava postojanjem tri vodonične veze između GC u poređenju sa dve u AT parovima. Zbog termičke mase-kapaciteta uređaja praksa je da se ovi koraci vrše po dva minuta pošto tek nakon tog vremena možemo zasigurno da kažemo da je ta temperatura dostignuta. Inače sa novijim uređajima vremena od 1s su uspješno korišćene.
2. Kada se lanci DNK molekula razdvoje, temperatura se snizi kako bi se prajmeri samostalno vezali na oba razdvojena lanca. Prajmeri obično u sekvenci imaju po dvadesetak nukleotida pa naviše. Ovaj broj omogućava specifičnost veze, tj. da će se prajmeri vezati na željenu lokaciju. Temperatura shodno tome zavisi od dužine i nukleotidnog sastava prajmera, i obično je oko 5°S ispod njihove tačke topljenja (45-60°S). Previsoka temperatura može da onemogući vezivanje prajmera na DNK, preniska nadovezivanje na više odredišta, a nedostatak početne količine DNK da se nadovežu sami na sebe stvarajući prajmer-dajmer formaciju. Ovaj korak traje najkraće od svih i ne bi trebalo da bude duži (u najgorem slučaju) od 30 sekundi.
3. I na kraju, DNK polimeraza mora da popuni praznine na lancima, tako što počne od početnog prajmera i ide duž celog DNK molekula. Ovaj korak se naziva elongacija. Temperatura elongacije zavisi od enzima DNK polimeraze koji se upotrebljava. Zavisno od enzima i njegove brzine, ona je obično 10-30 baznih parova u sekundi, gruba procena koja bi trebala da bude zadovoljavajuća bila bi npr. - za 400bp elongacija u trajanju od 15-40 sekundi.
- Molecular cloning [A lab manual] Sambrook and Russell, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.
- Mullis, Kary, Dancing in the Minefield, ISBN 0-679-77400-9.
